TOPO-TA Simple Lightning Cloning Kit現(xiàn)貨
可在室溫條件下表示，20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆關鍵技術，陽性率接近100%集中展示，并且免冰浴組成部分、免熱激深入闡釋、免藍白斑篩選，還可以連接長達10kb的DNA片段高效化。TOPO-TA Simple Lightning Cloning Kit現(xiàn)貨
TOPO-TA Simple Lightning Cloning Kit
（不含酶切位點）
TOPO-TA Simple Lightning Cloning Kit現(xiàn)貨
目錄號：42115
產(chǎn)品內(nèi)容：
產(chǎn)品成份 | 42115-20 (20 rxn) | 42115-80（80 rxn） |
pTOPO-TA/Blunt Vector(30ng/ul) | 20 ul | 80 ul |
1000bp Control (30ng/ul) | 5 ul | 5 ul |
10x Enhancer | 20 ul | 80 ul |
保存條件：
-20℃大大提高，存放 12 個月，不影響使用效果去完善。
產(chǎn)品簡介：
可在室溫條件下意料之外，20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆，陽性率接近100%項目，并且免冰浴相對開放、免熱激、免藍白斑篩選綜合運用，還可以連接長達10kb的DNA片段相貫通。
克隆步驟（≤3kb 片段）： 簡化步驟（≤10kb 片段）-- 免復(fù)蘇，免液體 LB
1脫穎而出、連接：室溫 5 分鐘系統； 1、連接: 37℃連接 5 min積極影響。
2方法、轉(zhuǎn)化：室溫 5 分鐘； 2進一步提升、轉(zhuǎn)化：冰浴 5 min進行探討，42℃熱激 1 min，冰上 2 min提供有力支撐。
3管理、復(fù)蘇：180rpm、37℃振蕩培養(yǎng) 10 分鐘越來越重要；涂板切實把製度。 3優化上下、取全部菌液涂板，37℃倒置培養(yǎng)最新。
操作步驟：
1. PCR 產(chǎn)物的制備：
a. 引物要求：引物不能磷酸化發揮重要作用。
b. 酶的選擇：根據(jù)需要選擇DNA 聚合酶，該載體兼容PCR 產(chǎn)物的A 末端和平末端模樣。
c. 電泳檢測 PCR 產(chǎn)物的量和質(zhì)量：
①僅有目的條帶取得顯著成效，可直接進行連接反應(yīng)，無需純化過程中；
②如果有多條帶振奮起來，建議凝膠回收 DNA 片段（DC011-100）;
③如果以質(zhì)粒為模板的擴增，則必須進行凝膠回收特征更加明顯，因為模板質(zhì)粒也會長出非目的菌落長足發展。
2. 連接反應(yīng)：
1） 室溫（20℃-37℃）建立連接體系（10ul 體系）：
純化后的 PCR 產(chǎn)物 | 0.5-8ul |
pTOPO-TA/blunt Vector | 1ul |
10 ? Enhancer | 1 ul |
滅菌水 | X ul |
總體積 | 10 ul |
不同大小插入片段的推薦用量：
插入片段大小（bp） | 最佳用量（ng） |
100-1000 | 10-40 |
1000-2000 | 40-80 |
2000-5000 | 80-150 |
加完試劑后足了準備，輕彈管底混勻（或輕輕吹打混勻）規模設備，點甩離心收集所有液體在離心管底。
2) 室溫（20℃-37℃）連接 5 分鐘穩步前行。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞至關重要，或置于冰上備用。
3. 轉(zhuǎn)化指導、復(fù)蘇建設項目、涂板：
1）100ul 感受態(tài)細胞，置于室溫解凍（約 1 分鐘左右）服務品質，輕撣幾次將細胞均勻懸浮傳遞。
2） 加入 10ul 連接液，輕輕混勻過程，室溫（20℃-37℃）放置 5 分鐘的發生。
3） 加入 500ul 平衡至室溫的 LB 或者 SOC 培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm 振蕩培養(yǎng) 10 min進一步完善。
（注意：大于 3kb 的片段相結合，振蕩培養(yǎng)時間延長至 30-60 分鐘，可以增加轉(zhuǎn)化子影響∠嚓P性；蛘哂煤喕襟E）
4） 取 200?l 菌液涂板(含氨芐青霉su 50-100ug/ml），培養(yǎng)過夜製高點項目。（為得到較多克隆的必然要求，4000 rpm 離心 1 min，吸棄掉部分上清，保留 100-150ul發展基礎，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）
注意：如果使用 5ul 體系有很大提升空間，各成分按照比例減半要求，使用次數(shù)可以加倍。
4. 轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：
本制品陽性率相當高認為，一般情況下運行好，可以達到所見即所得，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌拓展應用，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少）非常重要，基本就包含插入。因此插入片段不超過 2-3kb 的情況下可以不用鑒定直接挑 1-2 個菌去測序自動化方案。
1） 菌落 PCR 檢測：挑單菌落于 10ul 無菌水中行動力，混勻，取 1ul 置于 25ul PCR 體系,用 PCR 引物或者M13 通用引物去鑒定陽性克隆空間廣闊。
2） 用通用 M13F（-20）/M13R（-26）引物測序來確定是否含有目的克隆落到實處。
TOPO-TA Simple Lightning Cloning Kit現(xiàn)貨
