TOPO-TA/Blunt Lightning Cloning Kit-
可在室溫條件下，20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆表示，陽性率接近100%成就，并且免冰浴、免熱激生產效率、免藍(lán)白斑篩選反應能力，還可以連接長(zhǎng)達(dá)10kb的DNA片段。TOPO-TA/Blunt Lightning Cloning Kit-
TOPO-TA/Blunt Lightning Cloning Kit（含酶切位點(diǎn)）
TOPO-TA/Blunt Lightning Cloning Kit-
目錄號(hào)：42211
產(chǎn)品內(nèi)容：
產(chǎn)品成份 | 42211-20 (20 rxn) | 42211-80（80 rxn） |
pTOPO-TA/Blunt Vector (30ng/ul) | 40 ul | 160 ul |
1000bp Control (30ng/ul) | 5 ul | 5 ul |
10x Enhancer | 20 ul | 20 ul |
保存條件：
-20℃競爭激烈，存放 12 個(gè)月投入力度，不影響使用效果。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
可在室溫條件下學習，20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆技術，陽性率接近100%，并且免冰浴、免熱激結構重塑、免藍(lán)白斑篩選，還可以連接長(zhǎng)達(dá)10kb的DNA片段空白區。
克隆步驟（≤3kb 片段）： 簡(jiǎn)化步驟（≤10kb 片段）-- 免復(fù)蘇貢獻法治，免液體 LB
1、連接：室溫 5 分鐘應用優勢； 1相對較高、連接: 37℃連接 5 min。
2發展需要、轉(zhuǎn)化：室溫 5 分鐘創新內容； 2、轉(zhuǎn)化：冰浴 5 min信息，42℃熱激 1 min實踐者，冰上 2 min。
3力量、復(fù)蘇：180rpm達到、37℃振蕩培養(yǎng) 10 分鐘深入各系統；涂板大型。 3、取全部菌液涂板進一步推進，37℃倒置培養(yǎng)不可缺少。
操作步驟：
1. PCR 產(chǎn)物的制備：
a. 引物要求：引物不能磷酸化。
b. 酶的選擇：根據(jù)需要選擇DNA 聚合酶明確相關要求，該載體兼容PCR 產(chǎn)物的A 末端和平末端服務為一體。
c. 電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物的量和質(zhì)量：
①僅有目的條帶方案，可直接進(jìn)行連接反應(yīng)，無需純化相互配合；
②如果有多條帶統籌發展，建議凝膠回收 DNA 片段（DC011-100）;
③如果以質(zhì)粒為模板的擴(kuò)增，則必須進(jìn)行凝膠回收積極回應，因?yàn)槟０遒|(zhì)粒也會(huì)長(zhǎng)出非目的菌落慢體驗。
2. 連接反應(yīng)：
1） 室溫（20℃-37℃）建立連接體系（10ul 體系）：
純化后的 PCR 產(chǎn)物 | 0.5-5 ul |
pTOPO-TA/blunt Vector | 2 ul |
10 ? Enhancer | 1 ul |
滅菌水 | X ul |
總體積 | 10 ul |
不同大小插入片段的推薦用量：
插入片段大小（bp） | 最佳用量（ng） |
100-1000 | 10-40 |
1000-2000 | 40-80 |
2000-5000 | 80-180 |
加完試劑后全會精神，輕彈管底混勻（或輕輕吹打混勻）左右，點(diǎn)甩離心收集所有液體在離心管底。
2) 室溫（20℃-37℃）連接 5 分鐘智能化。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞生產製造，或置于冰上備用。
3. 轉(zhuǎn)化綜合措施、復(fù)蘇多元化服務體系、涂板：
1）100ul 感受態(tài)細(xì)胞，置于室溫解凍（約 1 分鐘左右）攜手共進，輕撣幾次將細(xì)胞均勻懸浮培訓。
2） 加入 10ul 連接液，輕輕混勻使用，室溫（20℃-37℃）放置 5 分鐘。
3） 加入 500ul 平衡至室溫的 LB 或者 SOC 培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm 振蕩培養(yǎng) 10 min建言直達。
（注意：大于 3kb 的片段大幅拓展，振蕩培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至 30-60 分鐘，可以增加轉(zhuǎn)化子新體系∈姑熑?；蛘哂煤?jiǎn)化步驟）
4） 取 200?l 菌液涂板(含氨芐青霉su 50-100ug/ml），培養(yǎng)過夜搖籃。（為得到較多克隆持續創新，4000 rpm 離心 1 min，吸棄掉部分上清使用，保留 100-150ul分析，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）
注意：如果使用 5ul 體系不難發現，各成分按照比例減半合規意識，使用次數(shù)可以加倍。
4. 轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：
本制品陽性率相當(dāng)高推動，一般情況下協調機製，可以達(dá)到所見即所得設備製造，只要是長(zhǎng)出來的菌落正常（不是污染的雜菌，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少）高質量發展，基本就包含插入資源配置。因此插入片段不超過 2-3kb 的情況下可以不用鑒定直接挑 1-2 個(gè)菌去測(cè)序。
1） 菌落 PCR 檢測(cè)：挑單菌落于 10ul 無菌水中攻堅克難，混勻高端化，取 1ul 置于 25ul PCR 體系,用 PCR 引物或者M(jìn)13 通用引物去鑒定陽性克隆。
2）用通用 M13F（-20）/M13R（-26）引物測(cè)序來確定是否含有目的克隆姿勢。
TOPO-TA/Blunt Lightning Cloning Kit-
