零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理載體
零背景平末端快速連接試劑盒是一種先進(jìn)的zi殺基因陽性選擇克隆系統(tǒng)高效，可以高效克隆平末端 PCR 產(chǎn)物和任何具有平末端的DNA 片段。該試劑盒對磷酸化或非磷酸化的 DNA 片段都有效行業內卷。零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理載體
ZERO-Blunt零背景平末端快速克隆試劑盒
零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理載體
目錄號：42018
試劑盒組成實施體系、儲存臺上與臺下、穩(wěn)定性：
試劑盒組成 | 20次(42018-20) | 40次(42018-40) |
pZERO-Blunt Vector(40ng/ml) | 20 ml | 40 ml |
1K bp Control（40ng/ml） | 5 ml | 5 ml |
2 ′ Quick Ligation Buffer | 100 ml | 200 ml |
T4 DNA ligase, 5U/ml | 20 ml | 40 ml |
pZERO-Blunt Forward Sequencing Primer (10µM) | 100 ml | 200 ml |
pZERO-Blunt Reverse Sequencing Primer (10µM) | 100 ml | 200 ml |
－20℃儲存，6個月內(nèi)不影響使用效果技術創新。
v 產(chǎn)品介紹：
零背景平末端快速連接試劑盒是一種先進(jìn)的zi殺基因陽性選擇克隆系統(tǒng)效高性，可以高效克隆平末端 PCR 產(chǎn)物和任何具有平末端的DNA 片段。該試劑盒對磷酸化或非磷酸化的 DNA 片段都有效技術發展。 陽性選擇載體和插入片段連接僅需 5 分鐘即可獲得超過 95%的陽性重組克隆重要的作用。由具有校正活性的聚合酶（如：Pfu polymerase）擴(kuò)增的平末端 PCR 產(chǎn)物可直接連入克隆載體。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化常用的大腸桿菌菌株質量。
試劑盒提供一個新穎的zi殺基因陽性選擇克隆載體pZERO-Blunt。該載體含有致死的zi殺基因（內(nèi)含多克隆位點），當(dāng)載體與片段連接成功不久前，zi殺基因無法正確表達(dá)緊迫性，包含重組子的細(xì)胞可以正常生長；當(dāng)載體與片段連接不成功機構，載體自連后zi殺基因正確表達(dá)非常激烈，包含自連空載體的細(xì)胞無法存活提升行動，即“零ZERO"背景。這種陽性篩選策略無需藍(lán)白斑篩選技術交流，極大地加速了克隆篩選進(jìn)程交流。
為方便酶切作圖和插入片段基因操作，pZERO-Blunt克隆載體的多克隆位點兩側(cè)各包含一個BglII識別序列關註。此外溝通協調，該載體含有T7啟動子，可用于體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄提供堅實支撐、插入片段測序等研究活動。
操作步驟：
1. 連接反應(yīng)的準(zhǔn)備：
平末端PCR產(chǎn)物或者酶切后平末端片段可以通過瓊脂糖凝膠電泳分離回收（使用長波紫外光下切膠或者可見光透射切膠避免DNA損傷造成連接失敗）創造更多。與載體的摩爾比是 3:1還不大。本公司生產(chǎn)的DNA產(chǎn)物快速純化回收試劑盒對70bp以上的DNA片段能很好地進(jìn)行回收。
2. 快速連接反應(yīng)：
1) 在一個標(biāo)準(zhǔn)的10 ml連接反應(yīng)體系中連日來，加入1 ml 40ng pZERO-Blunt 載體保障性、X ml PCR產(chǎn)物(在通常狀況下，沒有必要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行精確定量信息化技術，一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1就可以得到良好結(jié)果領先水平，推薦3:1，見附錄)責任製、5ml 2 ′ Quick ligation Buffer和0.9ml 的T4 DNA Ligase確定性，其余用滅菌水補足。
反應(yīng)按以下體系進(jìn)行：
5ml | 2 ′ Quick Ligation Buffer |
1ml | pZERO-Blunt 載體 |
Xml | 純化后的PCR產(chǎn)物/或者1ml 1000bp control |
Yml | 滅菌水 |
0.9ml (5 Weiss Units/ml) | T4 DNA Ligase |
Final Volume | 10ml |
一般最后加入T4 DNA Ligase去完善。
2) 22℃連接5-10分鐘（一般可在PCR儀器完成）。
通常推薦22℃連接5-10分鐘 必然趨勢，>3kb長片段連接可以延長至30分鐘設備。不推薦超過30分鐘，超過可能降低轉(zhuǎn)化子數(shù)量效高。
3) 冰上冷卻建設應用，然后轉(zhuǎn)化或貯存于-20℃。
3. 轉(zhuǎn)化：
1) 100ml感受態(tài)細(xì)胞廣度和深度，置于冰上應用的因素之一，wan全解凍后輕撣幾次將細(xì)胞均勻懸浮。
2) 加入4－5ml連接液(最多可全部加入日漸深入，只要連接液體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10)奮勇向前，輕輕混勻。冰上放置30分鐘預期。
3) 42℃水浴熱激90秒經驗。冰上放置2~3分鐘。
4) 加500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 150 rpm振蕩培養(yǎng)60分鐘敢於監督。
5) 將200ml細(xì)菌涂布在氨芐青霉su(100mg/ml)平板上對外開放。
涂布細(xì)菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細(xì)胞的感受率而進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，如果 預(yù)計的克隆較少組建，可通過離心（4,000rpm用的舒心，2 分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液，留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個平板中（涂布剩余的菌液可以擱在4度保存深入交流研討，第2天如果轉(zhuǎn)化菌落數(shù)量少模式，可將剩余菌液全部涂一個新培養(yǎng)板)。
6) 平板在37℃下正向放置1小時以吸收過多的液體品牌，然后倒置培養(yǎng)過夜適應能力。
5 篩選：
1). 常規(guī)檢測：將得到的菌落接種 1-5 ml LB（含有終濃度為 100mg /ml 的氨芐青霉su）培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜節點，保存菌種后提取質(zhì)粒快速增長，應(yīng)用 PCR 或酶切方法鑒定插入片段是否正確。
2). 快速檢測：挑取菌落直接進(jìn)行PCR檢測（可參見分子克隆第3版本或者參考本公司CV05-通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒說明書）。
3). 測序鑒定：使用試劑盒自帶引物或者T7啟動子引物測序確定是否含有目的克隆通過活化。
本試劑盒自帶測序引物（也用于菌落PCR鑒定引物）：
Forward sequencing primer, 23-mer | 5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’ |
Reverse sequencing primer, 24-mer | 5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’ |
v 附錄：
e 如何計算連接反應(yīng)中需要的PCR產(chǎn)物的量?
一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1（推薦3:1）就可以得到良好結(jié)果，可采用以下公式：
[加入載體的量（ng）×插入片段大械刃问?。╧b）÷載體大蟹揽?。╧b）]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量（ng） 例如：插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1，如連接反應(yīng)中加入載體40ng的特點，插入片段大小為500bp先進的解決方案，這時應(yīng)加入插入片段的量為[40ng載體×0.5kb插入片段÷2.974kb載體]×3/1=20.2ng。
零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理載體
