零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
零背景平末端快速連接試劑盒是一種優(yōu)良的zi殺基因陽性選擇克隆系統(tǒng)作用，可以高效克隆平末端 PCR 產(chǎn)物和任何具有平末端的DNA 片段等特點。該試劑盒對磷酸化或非磷酸化的 DNA 片段都有效品牌。 陽性選擇載體和插入片段連接僅需 5 分鐘即可獲得超過 90%的陽性重組克隆。零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
Zero-Blunt Simple Quick Ligation Kit
pZERO-Blunt Simple零背景平末端快速連接試劑盒
(不含MCS)
零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
目錄號：42113
試劑盒組成組建、儲存、穩(wěn)定性：
試劑盒組成 | 20次(42113-20) | 40次(42113-40) |
pZERO-Blunt Simple Vector(40ng/ml) | 20 ml | 40 ml |
1K bp Control（40ng/ml） | 5 ml | 5 ml |
2 ′ Quick Ligation Buffer | 100 ml | 200 ml |
T4 DNA ligase, 5U/ml | 20 ml | 40 ml |
pZERO-Blunt Simple Forward Sequencing Primer (10µM) | 100 ml | 200 ml |
pZERO/Blunt Simple Reverse Sequencing Primer (10µM) | 100 ml | 200 ml |
－20℃儲存服務體系，6個月內不影響使用效果進展情況。
產(chǎn)品介紹：
零背景平末端快速連接試劑盒是一種優(yōu)良的zi殺基因陽性選擇克隆系統(tǒng)，可以高效克隆平末端 PCR 產(chǎn)物和任何具有平末端的DNA 片段特點。該試劑盒對磷酸化或非磷酸化的 DNA 片段都有效研究。 陽性選擇載體和插入片段連接僅需 5 分鐘即可獲得超過 90%的陽性重組克隆。由具有校正活性的聚合酶（如：Pfu polymerase）擴增的平末端PCR產(chǎn)物可直接連入克隆載體綠色化發展。連接產(chǎn)物可直接轉化常用的大腸桿菌菌株去創新。
試劑盒提供一個新穎的zi殺基因陽性選擇克隆載體pZERO-Blunt Simple。該載體含有致死的zi殺基因應用創新，當載體與片段連接成功體系，zi殺基因無法正確表達，包含重組子的細胞可以正常生長和諧共生；當載體與片段連接不成功提高，載體自連后zi殺基因正確表達全面闡釋，包含自連空載體的細胞無法存活，即“零ZERO"背景結構。這種陽性篩選策略無需藍白斑篩選適應性強，極大地加速了克隆篩選進程。
pZERO-Blunt Simple消除了插入位點附近的多克隆酶切位點競爭力所在，需要在PCR擴增引物上導入合適的酶切位點能力建設。此時如果使用PCR擴增引物導入的酶切位點進行DNA酶切時，酶切反應將不會受到T載體上其它多克隆酶切位點上的限制酶影響先進的解決方案，可以大大提高酶切效率攜手共進，增加亞克隆成功率。
操作步驟：
1. 連接反應的準備：
平末端PCR產(chǎn)物或者酶切后平末端片段可以通過瓊脂糖凝膠電泳分離回收（使用長波紫外光下切膠或者可見光透射切膠避免DNA損傷造成連接失斪匀粭l件。U大公共數據。與載體的摩爾比是 3:1。本公司生產(chǎn)的DNA產(chǎn)物快速純化回收試劑盒對70bp以上的DNA片段能很好地進行回收全過程。
2. 快速連接反應：
1) 在一個標準的10 ml連接反應體系中更高要求，加入1 ml 40ng pZERO-Blunt Simple載體、X ml PCR產(chǎn)物(在通常狀況下優勢領先，沒有必要對PCR產(chǎn)物進行精確定量經驗分享，一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1就可以得到良好結果，推薦3:1新技術，見附錄)培養、5ml 2 ′ Quick ligation Buffer和0.9ml 的T4 DNA Ligase，其余用滅菌水補足趨勢。
反應按以下體系進行：
5ml | 2 ′ Quick Ligation Buffer |
1ml | pZERO-Blunt Simple載體 |
Xml | 純化后的PCR產(chǎn)物/或者1ml 1000bp control |
Yml | 滅菌水 |
0.9ml (5 Weiss Units/ml) | T4 DNA Ligase |
Final Volume | 10ml |
一般最后加入T4 DNA Ligase高效流通。
2) 22℃連接5-10分鐘（一般可在PCR儀器完成）。
通常推薦22℃連接5-10分鐘 ，>3kb長片段連接可以延長至30分鐘有力扭轉。不推薦超過30分鐘，超過可能降低轉化子數(shù)量深入。
3) 冰上冷卻形式，然后轉化或貯存于-20℃。
3. 轉化：
1) 100ml感受態(tài)細胞一站式服務，置于冰上功能，wan全解凍后輕撣幾次將細胞均勻懸浮。
2) 加入4－5ml連接液(最多可全部加入支撐作用，只要連接液體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10)積極性，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。
3) 42℃水浴熱激90秒高效節能。冰上放置2~3分鐘相關。
4) 加500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 150 rpm振蕩培養(yǎng)60分鐘基地。
5) 將200ml細菌涂布在氨芐青霉su(100mg/ml)平板上影響力範圍。
涂布細菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細胞的感受率而進行適當?shù)恼{整，如果 預計的克隆較少約定管轄，可通過離心（4,000rpm雙向互動，2 分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液，留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個平板中（涂布剩余的菌液可以擱在4度保存的積極性，第2天如果轉化菌落數(shù)量少更多可能性，可將剩余菌液全部涂一個新培養(yǎng)板)。
6) 平板在37℃下正向放置1小時以吸收過多的液體高效，然后倒置培養(yǎng)過夜分析。
4. 篩選：
5. 常規(guī)檢測：將得到的菌落接種 1-5 ml LB（含有終濃度為 100mg /ml 的氨芐青霉su）培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜質量，保存菌種后提取質粒，應用 PCR 或酶切方法鑒定插入片段是否正確。
6. 快速檢測：挑取菌落直接進行PCR檢測（可參見分子克隆第3版本或者參考本公司CV05-通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒說明書）不久前。
7. 測序鑒定：使用試劑盒自帶引物或者T7啟動子引物測序確定是否含有目的克隆緊迫性。
本試劑盒自帶測序引物（也用于菌落PCR鑒定引物）：
Forward sequencing primer, 23-mer | 5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGTC- 3’ |
Reverse sequencing primer, 24-mer | 5’-AAGAACATCGCTTTTCGATGGCAG- 3’ |
附錄：
e 如何計算連接反應中需要的PCR產(chǎn)物的量?
一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1（推薦3:1）就可以得到良好結果，可采用以下公式：
[加入載體的量（ng）×插入片段大袡C構。╧b）÷載體大蟹浅＜ち?。╧b）]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量（ng） 例如：插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1，如連接反應中加入載體40ng更適合，插入片段大小為500bp技術交流，這時應加入插入片段的量為[40ng載體×0.5kb插入片段÷2.974kb載體]×3/1=20.2ng。
零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
