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pBLUE -T 載體克隆試劑盒 T4原理載體及其他

• 型   號：42014
• 價   格：
• 更新時間：2025-04-24
• 廠家性質(zhì)：經(jīng)銷商

許多高溫DNA聚合酶特點，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等擴增的PCR產(chǎn)物在3’-末端后都帶有一個突出的堿基A設施，這樣的PCR產(chǎn)物可以用3’-末端后帶有一個突出堿基T的載體方便地進行克隆。
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pBLUE -T 載體克隆試劑盒

pBLUE -T 載體克隆試劑盒 T4原理載體及其他

目錄號：42014

試劑盒組成服務體系、儲存進展情況、穩(wěn)定性：

－20℃儲存，6個月內(nèi)不影響使用效果特點。

產(chǎn)品介紹：

許多高溫DNA聚合酶明確相關要求，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等擴增的PCR產(chǎn)物在3’-末端后都帶有一個突出的堿基A方案，這樣的PCR產(chǎn)物可以用3’-末端后帶有一個突出堿基T的載體方便地進行克隆。pBLUE-T 載體來源于pBlueScript II SK(+) 質(zhì)粒相互配合，在EcoRI酶切位點處添加了適當序列統籌發展，經(jīng)XCM I 酶切后其3’末端直接產(chǎn)生未配對的T堿基而成，因此有更高的重組效率積極回應。pBLUE-T 載體插入位點兩端du特設(shè)計的兩個ECOR I位點使插入片段可以用廉價高效的ECOR I單酶切檢測慢體驗； 同時pBLUE-T 載體不含NdeI或NcoI限制性內(nèi)切酶位點，可方便用于克隆含上述酶切位點的基因全會精神。此外左右，本公司載體連接體系還有背景低（藍斑小于10%），重組率高（白斑中超過90%有插入片段）智能化，可快速連接等特點生產製造。本說明書末列出了pBLUE-T 載體相關(guān)的技術(shù)資料拓展基地，其全序列可參照pBlueScript II SK(+)序列，只是其多克隆酶切位點處序列稍有不同多元化服務體系。

測序可以采用T3處理、T7啟動子引物和M13通用測序引物（見后面圖譜）

操作步驟：

1. 連接反應(yīng)的準備：

PCR產(chǎn)物是否要進行純化取決于擴增產(chǎn)物的質(zhì)量。如果PCR產(chǎn)物非常干凈實力增強，不經(jīng)純化就可直接進行連接反應(yīng)自然條件。但如果是以質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物則必須進行純化，模板質(zhì)粒有可能也形成白斑。PCR產(chǎn)物可以通過瓊脂糖凝膠電泳分離體系流動性。本公司生產(chǎn)的DNA產(chǎn)物快速純化回收試劑盒對70bp以上的DNA片段能很好地進行回收。

Taq深度、Tth優勢領先、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物使命責任，其末端都帶有一個突出的3’ -A共謀發展。 具有3’ -A末端的PCR產(chǎn)物可以直接用pBLUE-T 載體進行克隆連接。具有3’®5’外切酶活性的DNA聚合酶（高保真酶）擴增的PCR產(chǎn)物是平末端持續創新，要對這種平末端PCR產(chǎn)物進行克隆創造，應(yīng)先進行3’-端加A工作。

2. 常規(guī)連接反應(yīng)：

1) 在一個標準的10 ml連接反應(yīng)體系中分析，加入1 ml 30ng pBLUE-T 載體、X ml PCR產(chǎn)物(在通常狀況下，沒有必要對PCR產(chǎn)物進行精確定量合規意識，一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至2:1~10:1就可以得到良好結(jié)果聽得懂，推薦3:1)、1ml 10′ligation Buffer和0.5-1ml (2.5 -5 Weiss Units)的T4 DNA Ligase協調機製，其余用水補足設備製造。反應(yīng)按以下體系進行：

一般最后加入T4 DNA Ligase。

2) 16℃連接過夜（一般可在PCR儀器完成）高質量發展。

通常推薦16℃連接過夜（10ml體系標準連接酶量為2.5 Weiss Units即可）資源配置，可以得到最多的轉(zhuǎn)化子。但是本系統(tǒng)含PEG Enhancer可以提高連接效率數(shù)倍攻堅克難，在高連接酶量的情況下（10ml體系推薦連接酶量為5 Weiss Units）16℃連接30分鐘即可達一般研究的要求機遇與挑戰。

3) 冰上冷卻，然后轉(zhuǎn)化或貯存于-20℃相關。

3. 快速連接反應(yīng)：

1) 反應(yīng)按以下體系進行：

一般最后加入T4 DNA Ligase取得明顯成效。

2) 22℃連接5-10分鐘（一般可在PCR儀器完成）。

2 ′Quick Ligation Buffer已經(jīng)包含所有優(yōu)化的快速連接成份影響力範圍，通常推薦22℃連接10分鐘（10ml體系連接酶量為5 Weiss Units大力發展，長片段連接可以延長至30分鐘）一般可以得到滿意結(jié)果約定管轄。此外本系統(tǒng)也可在16℃連接30分鐘（10ml體系連接酶量為5Weiss Units）即可達一般研究的要求。

3) 冰上冷卻提單產，然后轉(zhuǎn)化或貯存于-20℃核心技術。

4. 轉(zhuǎn)化：

e50-100ml感受態(tài)細胞，置于冰上設計，wan全解凍后輕撣幾次將細胞均勻懸浮創新能力。

e加入4－5ml連接液(最多可全部加入，只要體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10)應用的選擇，輕輕混勻效率。冰上放置30分鐘。42℃水浴熱激90秒逐漸顯現。冰上放置2~3分鐘十大行動。

e加500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 150 rpm振蕩培養(yǎng)60分鐘著力增加。

e將200ml細菌涂布在預(yù)先用16ml 50mg/ml IPTG和40ml 20 mg/ml X-gal 涂布的氨芐青霉su平板上體系。

涂布細菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細胞的感受率而進行適當?shù)恼{(diào)整，如果 預(yù)計的克隆較少背景下，可通過離心（4,000rpm多種場景，2 分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液，留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個平板中（涂布剩余的菌液可以擱在4度保存開展試點，第2天如果轉(zhuǎn)化菌落數(shù)量少集中展示，可將剩余菌液全部涂一個新培養(yǎng)板)。

e平板在37℃下正向放置1小時以吸收過多的液體規劃，然后倒置培養(yǎng)過夜建設。
5 篩選：

1). 轉(zhuǎn)化子的藍白篩選：

當外源DNA片段插入到pBLUE-T 中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼發展，從而影響了其產(chǎn)物b-半乳糖苷酶a-片段的活性，因此重組克隆在X-gal/IPTG平板上呈現(xiàn)為白色，而非重組克隆呈藍色推進一步。有的時候插入片段沒有影響lacZ 基因讀碼框宣講手段， 或插入片段太小，這種情況下菌落（重組克掳l行速度。┏尸F(xiàn)淡藍色或者在菌落中心呈現(xiàn)淡藍斑點，外圈白色（魚眼狀藍斑fish eye）強大的功能。選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落或者淡藍色菌落積極拓展新的領域，用牙簽挑至含氨芐青霉su的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜與時俱進。
2). 轉(zhuǎn)化子的鑒定：

a. 用上述培養(yǎng)的白色菌落的菌液抽提質(zhì)粒應用，用ECOR I 單酶切或用其它合適的酶切解決方案，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，確定是否含有目的片段成就。

b. 挑取白色菌落直接進行PCR檢測（可參見分子克隆第3版本或者咨詢我們）

c. 用T3和T7啟動子引物或其它合適的引物測序來確定是否含有目的克隆初步建立。

如何計算連接反應(yīng)中需要的PCR產(chǎn)物的量?

一般PCR產(chǎn)物與載體的摩爾比優(yōu)化至2:1~10:1（推薦3:1）就可以得到良好結(jié)果，可采用以下公式：

[加入載體的量（ng）×插入片段大忻芏仍黾?。╧b）÷載體大袘脙瀯?。╧b）]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量（ng） 例如：插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1，如連接反應(yīng)中加入載體40ng信息化，插入片段大小為1000bp發展需要，這時應(yīng)加入插入片段的量為[40ng載體×1kb插入片段÷2.984kb載體]×3/1=40.2ng。 

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